Mécanismes moléculaires contrôlant les cellules T à TCR présentant une affinité améliorée envers le cancer

Cette “bourse ISREC” a été attribuée à Efe Erdes en juillet 2015 pour une durée de quatre ans.

Efe Erdes effectue ses travaux dans les laboratoires de la Professeure Nathalie Rufer (département d'oncologie UNIL/CHUV).

 

Objectifs spécifiques

Les patients souffrant d’un cancer possèdent souvent de nombreux récepteurs des cellules T (TCR, T-cell receptor) spécifiques à la tumeur. Les avidités de ces TCR demeurent cependant relativement faibles, au point de ne plus produire une immunité anti-tumorale efficace. Etant donné ces limitations, il convient de trouver des moyens plus efficaces pour déterminer l’avidité de cellules T individuelles et pour activer préférentiellement les cellules T présentant des capacités fonctionnelles optimales. Au cours de ces dernières années, nous avons développé un modèle unique en son genre basé sur un panel de cellules T CD8 exprimant des TCR d’affinité croissante envers l’antigène tumoral NY-ESO-1. Ce modèle nous permet d’étudier le lien de causalité entre l’avidité des cellules T et l’activation et la fonction de ces cellules, ainsi que les mécanismes de signalisation sous-tendants. Nos recherches fournissent de nouvelles preuves que la réponse des cellules T anti-tumorales dépend du seuil d’affinité du TCR/pCMH. Nos travaux ont révélé de nouvelles voies de régulation et indiquent que des cellules T spécifiques à une tumeur et présentant une avidité forte ne sont pas forcément plus performantes.

L’objectif général de ce projet est de comprendre comment les cellules T détectent les différences en matière de force des interactions TCR/CMH, surtout par l’intermédiaire de la modulation de la signalisation induite par le TCR. Nous nous servirons ensuite d’expériences in vitro et de modèles murins in vivo pour caractériser l’impact du blocage de ces cibles moléculaires sur la réceptivité des cellules T aux cellules tumorales. Des résultats préliminaires confidentiels indiquent que les protéines Cbl (c-Cbl et Cbl-b) sont des molécules de régulation importantes dans les cellules T CD8 spécifiques à la tumeur et modifiées de manière à exprimer des TCR à affinité améliorée. Ces études soutiennent directement le développement de thérapies optimisant les voies de signalisation induites par le TCR, en vue de promouvoir les interventions immunitaires thérapeutiques telles que le transfert adoptif de cellules T ou la vaccination. Il se peut en outre que l’activation et la signalisation des cellules T soient limitées par un seuil d’affinité pour l’interaction TCR/pCMH, au-dessus duquel les cellules ne développent pas de fonctions productives.

 

1er objectif :
Analyse de l’impact de TCR à affinité améliorée envers des antigènes tumoraux sur l’expression de molécules impliquées dans la modulation/régulation immunitaire (p.ex. c-Cbl, Cbl-b)

2ème objectif :
Evaluation de l’impact de TCR à affinité améliorée dans des expériences de blocage visant des molécules cibles spécifiques des voies de signalisation induites par le TCR (p.ex. c-Cbl, Cbl-b)

3ème objectif :
Validation de l’impact de protéines cibles spécifiques sur les TCR à affinité améliorée envers les antigènes tumoraux dans un modèle murin immunodéficient NSG

 

Contexte et signification

Les cellules T cytotoxiques reconnaissent, par l’intermédiaire de leur TCR, les peptides antigéniques présentés par le CMH (pCMH) à la surface de cellules infectées ou malignes. L’affinité/avidité du TCR pour le pCMH est un paramètre clé de l’immunité à médiation cellulaire, puisque une forte liaison au pCMH confère des fonctions effectrices supérieures à celles obtenues lors d’une liaison faible. Ce phénomène est particulièrement intéressant dans le contexte de l’immunothérapie par transfert adoptif de cellules T. Celle-ci vise à conférer une réactivité immunitaire contre des antigènes tumoraux ou des auto-antigènes pour lesquels la réponse endogène des cellules T est d’ordinaire trop faible. Le transfert adoptif de cellules T modifiées augmente en effet la capacité fonctionnelle et protectrice de cellules T CD8 réactives à des antigènes tumoraux (Fig. 1) (1, 2). Les résultats d’essais cliniques récents indiquent toutefois que les TCR modifiés de manière à présenter une affinité accrue sont susceptibles d’engendrer des effets secondaires graves chez les patients en raison de réponses immunitaires cytotoxiques nocives in vivo (1, 3, 4). Il est indispensable de garantir la sécurité des cellules T porteuses de TCR modifiés dans les essais cliniques. L’optimisation du TCR moyennant une modification de l’affinité doit donc inclure une évaluation de la réceptivité optimale des cellules T et de l’absence d’effets secondaires (on-target et off-target) dus à une auto-réactivité (5). Ces dernières années, nous avons constitué un panel unique en son genre de cellules T CD8 humaines modifiées de manière à présenter des TCR d’affinité croissante. Ces TCR sont spécifiques à l’antigène tumoral NY-ESO-1 présenté par HLA-A2 et ont été conçus sur la base de prédictions structurales rationnelles (6, 7). Nous avons constaté que la fonction anti-tumorale des cellules T peut être améliorée en augmentant l’affinité TCR/pCMH dans l’intervalle physiologique. Paradoxalement, une augmentation au-delà de ces limites conduit à un déclin fonctionnel important (8, 9) (Fig. 2).

Notre étude a également révélé la présence d’une fenêtre d’affinité correspondant à une fonction optimale des cellules T et contrôlée par diverses molécules telles que le récepteur inhibiteur PD-1 et les phosphatases SHP-1 et SHP-2 (Fig. 2), connus pour réguler la signalisation, l’activation et la fonction subséquente des cellules T ((10) ; Presotto, Hebeisen et al., résultats non publiés). Considérés dans leur ensemble, nos résultats suggèrent qu’il existe plusieurs niveaux de contrôle dans les cellules T anti-tumorales exprimant des TCR à affinité améliorée.

Notre travail démontre également que l’affinité/avidité des TCR pour les auto-antigènes/antigènes tumoraux doit être optimisée avec soin moyennant une approche en plusieurs étapes afin (i) de maximiser la fonctionnalité des cellules T, (ii) d’éviter une toxicité associée à une destruction ciblée de tissu sain exprimant l’antigène ou à une perte de spécificité au niveau de la cible et (iii) de minimiser le régulation à la hausse de mécanismes de régulation inhibiteurs (appelés ci-après modulation/régulation immunitaire).

Actuellement, un objectif principal de ce projet consiste à identifier, dans notre panel de cellules T exprimant des TCR d’affinité croissante à l’antigène tumoral NY-ESO-1, les mécanismes moléculaires impliqués dans la régulation de la signalisation et de la fonction par l’intermédiaire de l’affinité des TCR. Dans le domaine d’affinité TCR/pCMH, nous caractériserons spécifiquement les acteurs moléculaires (p.ex. les protéines Cbl) impliqués dans la régulation négative de la cascade de signalisation dans laquelle le TCR sert de médiateur. Nous modulerons également ces molécules de manière à identifier leur impacte précis sur la fonction des cellules T envers les cellules tumorales. La compréhension de la régulation des cellules T et l’identification de cellules T spécifiques à des tumeurs et dotées d’une fonction optimisée contribuent au développement rationnel d’immunothérapies. Notre étude s’accorde avec un autre projet, récemment approuvé par le Fonds national suisse (FNS 310030-159417). Celui-ci se concentrera sur (i) l’étude approfondie de l’impact de l’avidité des TCR sur l’autoréactivité dirigée contre HLA-A2, qui conduit éventuellement à une expression accrue de régulateurs immunitaires tels que PD-1, et (ii) la génération de nouvelles variantes de TCR présentant une spécificité accrue envers le peptide, tout en évitant une autoréactivité face à HLA-A2.

 

Approche expérimentale

Les ubiquitine-ligases-E3 c-Cbl et Cbl-b jouent des rôles physiologiques essentiels. Ils servent, entre autres, de suppresseurs tumoraux et préviennent la transition d’une réponse immunitaire normale à une maladie auto-immunitaire (12). Les protéines Cbl-b et c-Cbl sont en particulier des régulateurs négatifs de la signalisation TCR. Elles ciblent des protéines pour la dégradation par ubiquitination (13). C-Cbl interagit avec Zap-70, encourageant ainsi l’ubiquitination de la chaîne CD3?, et provoque une régulation à la baisse de l’activation des TCR au cours de la sélection thymique positive. Cbl-b, en revanche, est essentiellement impliquée dans la régulation à la baisse de la signalisation TCR dans les cellules T périphériques matures. Notre hypothèse actuelle intègre le rôle clé de c-Cbl dans la modulation de l’activation proximale des TCR et de la signalisation dans le domaine d’affinité des TCR. Des résultats préliminaires indiquent qu’il existe une régulation à la hausse progressive de l’expression de c-Cbl dans les cellules T d’affinité croissante (Presotto, Hebeisen, Rufer et al., résultats non publiés). Nous formulons l’hypothèse que c-Cbl sert de mécanisme de retour d’information dépendant de l’affinité des TCR, et que celui-ci est impliqué dans un système ajustable permettant aux cellules T spécifiques à un antigène d’adapter leur réactivité à différentes conditions stimulatrices.

Dans le contexte de notre premier objectif, nous caractériserons, pour c-Cbl et Cbl-b, les états d’activation de base et suite à une stimulation spécifique au multimère (1, 5, 10 et 30 minutes) dans les cellules T CD8 exprimant des variantes TCR d’affinité croissante pour NY-ESO-1. Nous nous servirons à cette fin de la cytométrie en flux, d’un test phospho-flow récemment développé dans notre institut (14) et de Western blotting (10) pour évaluer soigneusement le rôle de l’expression de c-Cbl moyennant un anticorps monoclonal anti-phospho-c-Cbl (Tyr700 ; ref 558 100, BD Biosciences) récemment validé (Presotto, Hebeisen, Rufer et al., résultats non publiés). De façon similaire, nous testerons plusieurs anticorps monoclonaux contre la protéine Cbl-b humaine moyennant le test phospho-flow ou le Western blotting. Une fois validés, nous prévoyons d’évaluer l’impact de TCR à affinité améliorée sur le niveau d’expression de Cbl-b dans notre panel de cellules T porteuses de TCR modifiés. Nous caractériserons également l’expression de plusieurs molécules impliquées dans la signalisation induite par le TCR, notamment Zap-70, LAT, PLC-?, PI3K et SLP-76, qui sont sélectivement ubiquitinées par les protéines Cbl.

Dans le contexte de notre deuxième objectif, nous examinerons les mécanismes moléculaires impliqués dans la régulation inhibitrice de cellules T exprimant notre panel de TCR présentant une affinité croissante envers l’antigène tumoral NY-ESO-1 (Fig. 2). Moyennant une transduction d’un mutant c-Cbl C381A dépourvu d’activité ubiquitine ligase E3, ou en augmentant la concentration de la protéine c-Cbl par une transduction cytolytique (15), nous évaluerons la signification biologique de l’expression de c-Cbl dans ces cellules T à affinité améliorée. Ces expériences seront effectuées en collaboration avec la Dresse M.-A. Doucey (Département d’oncologie, CHUV-UNIL). Nous caractériserons ensuite l’impact fonctionnel de la diminution de l’activité enzymatique de c-Cbl ou de l’augmentation de la concentration en c-Cbl sur des expériences de modulation à la baisse de TCR (10), sur la signalisation induite par le TCR (p.ex. pCD3?, pZap70 et pERK moyennant un test phospho-flow, Presotto et al., résultats non publiés; test de mobilisation du calcium (10)) et sur la fonctionnalité (p.ex. la prolifération, la sécrétion de cytokines et la destruction de cellules cibles). Nous prévoyons d’effectuer des expériences similaires en bloquant l’expression de Cbl-b ou en sur-exprimant Cbl-b, et en déterminant son rôle précis dans les cellules T présentant une affinité améliorée des TCR.

Dans le contexte de notre troisième objectif, nous caractériserons l’impact in vivo de la protéine c-Cbl inhibée ou surexprimée enzymatiquement dans les cellules T CD8 présentant des TCR à affinité améliorée après un transfert adoptif dans des souris immunodéficientes NOD/SCID/?c-/- (NSG). Suite à la reconstitution avec ces diverses cellules T spécifiques à la tumeur, des lignées cellulaires HLA-A2/NY-ESO-1+ de mélanome humain (cellules Me 275 ou Me 290) seront greffées sur ces souris NSG. Les objectifs principaux sont l’expansion des cellules T spécifiques à la tumeur in vivo et l’étude de leurs capacités fonctionnelles d’identification et d’éradication de la tumeur.

Au cours des dernières années, nous avons développé un modèle puissant et unique en son genre permettant d’étudier l’impact précis de l’avidité TCR/pCMH sur divers paramètres biologiques, notamment la signalisation cellulaire, l’activation cellulaire et la fonction de cellules T spécifiques à une tumeur. Un objectif central du projet consiste en l’identification de molécules régulatrices clés gouvernant la signalisation contrôlée par l’affinité des TCR, la fonction et la modulation immunitaire. L’identification de ces mécanismes moléculaires (tels que c-Cbl et Cbl-b décrits ici) met en évidence le réseau régulateur complexe qui contrôle la réponse immunitaire des cellules T dans le cadre d’un cancer, de l’auto-immunité et des maladies infectieuses. A cet égard, c-Cbl représente un candidat très intéressant puisqu’on sait que cette molécule est recrutée par des récepteurs inhibiteurs à la surface des cellules T. Il a également été démontré qu’elle est préférentiellement régulée à la hausse dans les cellules T dont les TCR présentent l’affinité la plus élevée (Presotto, Hebeisen et al., résultats non publiés). Il est important de noter que les résultats d’études telles que celle présentée ici nous permettent d’augmenter nos connaissances générales en matière de réponses immunitaires induites par les cellules T et visant les cellules cancéreuses. Elles sont indispensables au développement de nouvelles immunothérapies

 

Esquisse générale du transfert adoptif de lymphocytes T à TCR modifiés dans les patients atteints d’un cancer. Isolement de cellules mononucléées du sang périphérique (a). Transduction des cellules T avec des TCR optimisés spécifiques (b). Expansion à court terme in vitro (c). Reperfusion de ces cellules T modifiées après une chimiothérapie transitoire (d).

 

Modèle illustrant le rapport entre la fonction des cellules T, l’affinité des TCR et les régulateurs négatifs (11). Grâce à notre panel unique en son genre de lymphocytes T CD8 modifiés de manière à présenter des TCR d’affinité croissante pour l’antigène tumoral NY-ESO-1, nous avons pu démontrer que le récepteur inhibiteur PD-1 et la phosphatase SHP-1 sont impliqués dans la restriction de l’activation des cellules T et de la réceptivité dépendante de l’affinité des TCR (10, 11).

 

Références
1.    Johnson LA, Morgan RA, Dudley ME, Cassard L, Yang JC, Hughes MS, Kammula US, Royal RE, Sherry RM, Wunderlich JR, et al. Gene therapy with human and mouse T-cell receptors mediates cancer regression and targets normal tissues expressing cognate antigen. Blood. 2009;114(3):535-46.

2.    Robbins PF, Morgan RA, Feldman SA, Yang JC, Sherry RM, Dudley ME, Wunderlich JR, Nahvi AV, Helman LJ, Mackall CL, et al. Tumor regression in patients with metastatic synovial cell sarcoma and melanoma using genetically engineered lymphocytes reactive with NY-ESO-1. J Clin Oncol. 2011;29(7):917-24.

3.    June CH, Maus MV, Plesa G, Johnson LA, Zhao Y, Levine BL, Grupp SA, and Porter DL. Engineered T cells for cancer therapy. Cancer Immunol Immunother. 2014;63(9):969-75.

4.    Morgan RA, Chinnasamy N, Abate-Daga D, Gros A, Robbins PF, Zheng Z, Dudley ME, Feldman SA, Yang JC, Sherry RM, et al. Cancer regression and neurological toxicity following anti-MAGE-A3 TCR gene therapy. J Immunother. 2013;36(2):133-51.

5.    Stone JD, and Kranz DM. Role of T cell receptor affinity in the efficacy and specificity of adoptive T cell therapies. Front Immunol. 2013;4:244.

6.    Zoete V, Irving MB, and Michielin O. MM-GBSA binding free energy decomposition and T cell receptor engineering. J Mol Recognit. 2010;23(2):142-52.

7.    Zoete V, Irving M, Ferber M, Cuendet MA, and Michielin O. Structure-Based, Rational Design of T Cell Receptors. Front Immunol. 2013;4:268.

8.    Schmid DA, Irving MB, Posevitz V, Hebeisen M, Posevitz-Fejfar A, Sarria JC, Gomez-Eerland R, Thome M, Schumacher TN, Romero P, et al. Evidence for a TCR affinity threshold delimiting maximal CD8 T cell function. J Immunol. 2010;184(9):4936-46.

9.    Irving M, Zoete V, Hebeisen M, Schmid D, Baumgartner P, Guillaume P, Romero P, Speiser D, Luescher I, Rufer N, et al. Interplay between T cell receptor binding kinetics and the level of cognate peptide presented by major histocompatibility complexes governs CD8+ T cell responsiveness. J Biol Chem. 2012;287(27):23068-78.

10.  Hebeisen M, Baitsch L, Presotto D, Baumgaertner P, Romero P, Michielin O, Speiser DE, and Rufer N. SHP-1 phosphatase activity counteracts increased T cell receptor affinity. J Clin Invest. 2013;123(3):1044-56.

11.  Hebeisen M, Oberle SG, Presotto D, Speiser DE, Zehn D, and Rufer N. Molecular insights for optimizing T cell receptor specificity against cancer. Front Immunol. 2013;4:154.

12.  Mohapatra B, Ahmad G, Nadeau S, Zutshi N, An W, Scheffe S, Dong L, Feng D, Goetz B, Arya P, et al. Protein tyrosine kinase regulation by ubiquitination: critical roles of Cbl-family ubiquitin ligases. Biochim Biophys Acta. 2013;1833(1):122-39.

13.  Barrera-Vargas A, Gomez-Martin D, and Alcocer-Varela J. T cell receptor-associated protein tyrosine kinases: The dynamics of tolerance regulation by phosphorylation and its role in systemic lupus erythematosus. Hum Immunol. 2014.

14.  Baumgaertner P, Jandus C, Rivals JP, Derre L, Lovgren T, Baitsch L, Guillaume P, Luescher IF, Berthod G, Matter M, et al. Vaccination-induced functional competence of circulating human tumor-specific CD8 T-cells. Int J Cancer. 2011.

15.  Brembilla NC, Weber J, Rimoldi D, Pradervand S, Schutz F, Pantaleo G, Ruegg C, Quadroni M, Harshman K, and Doucey MA. c-Cbl expression levels regulate the functional responses of human central and effector memory CD4 T cells. Blood. 2008;112(3):652-60.

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